.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=..=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=..=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.
ACTUALIZACION (26/04/2023): The Conversation me invitó a escribir sobre esta investigación en su página web. El artículo está disponible aquí.
ACTUALIZACIÓN (21/04/2023): Sarah Gregory del podcast de la revista del CDC me invitó a uno de sus programas. Aquí está la entrevista completa. El programa es en inglés.
.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=..=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=..=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.=.
Daniel Romero-Alvarez, Daniel Garzon-Chavez
Fig 1. Mycobacterium leprae es un bacilo gram positivo intracelular de crecimiento lento. Panel izquierdo tomado de Vera-Cabrera et al. 2022; panel derecho tomado del artículo de Labroots.
Cuenta la leyenda que en una conferencia se sugirió que el bacilo causante de la lepra, Mycobacterium leprae, prefería vivir en bajas temperaturas. Esta idea tenía un origen clínico, la mayoría de lesiones de lepra en seres humanos se concentran en las extremidades y en áreas "frías" como las orejas o la nariz. Para este punto (~1960), una de las características más importantes de esta bacteria estaba clara: no es posible cultivarla en medios microbiológicos artificiales. En ningún medio. En serio, varios investigadores y doctores lo han intentado sin éxito.
Mycobacterium leprae fue descrita por primera vez en 1873 por Gerhard-Henrik Armauer Hansen, de ahí el nombre del bacilo y la enfermedad de Hansen. Esto ocurrió en Noruega, EN NORUEGA, no en India, Israel o Brasil. En lo más nórdico de las latitudes europeas donde la incidencia alcanzaba los 25 en 10,000 habitantes (o sea un montón). Por algún motivo que nadie ha llegado a dilucidar, la incidencia de lepra en el viejo continente declinó hasta casi desaparecer. Por su naturaleza incultivable, más o menos en los 60s del siglo XX se concluyó que la única forma de obtener bacilos era infectando la almohadilla de las patas posteriores de ratones.
La imposibilidad de cultivar M. leprae explica en parte muchos de los vacíos de conocimiento que tenemos. No es como M. tuberculosis que se puede cultivar en el medio Löwenstein-Jensen y desarrollar colonias de bacterias puras en tres semanas. Aislar bacterias puras permite realizar pruebas de resistencia bacteriana, mirar sus características fenotípicas en la caja petri o en el microscopio, o explicar a detalle sus mecanismos de transmisión. Para hacer lo mismo con M. leprae se necesita primero tener una colonia de ratones e infectarlos con la bacteria aislada directamente de lesiones de piel humanas. Cómo es una de las bacterias de crecimiento más lento del reino unicelular (i.e., se multiplica cada 12 días), hay que esperar aproximadamente nueve meses para acumular suficientes bacilos y confirmar vía microscópica que las bacterias están vivas y creciendo. A veces el procedimiento funciona, a veces no, especialmente si es que solo hay escasos bacilos en la biopsia humana usada para la inoculación inicial o si la infección de los ratones es realizada pasado los tres días (tiene que hacerse antes!!!!). Entonces, estos experimentos son largos, técnicamente desafiantes y muy caros (cuidar muchos ratones por muchos meses), por ende hay muy pocos laboratorios capaces de tal hazaña.
Fig 2. Pata posterior de un ratón infectado con Mycobacterium leprae. En el panel derecho se observan macrófagos inundados de la bacteria. Imagen tomada de Scollard et al. 2006.
Entre las piezas del rompecabezas de la lepra, está el hecho de que desconocemos a cabalidad su mecanismo de transmisión. Personalmente, este detalle me llevó (Daniel Romero-Álvarez) a explorar este sistema para la tesis de doctorado. Parece inaudito que una enfermedad con tanta historia literal (>150 años de descripción) y cultural (asoma hasta en la Biblia), carezca de este entendimiento. Lo que se sabe y se acepta de cómo se produce la infección de lepra incluye la exposición crónica a la fuente y rutas de transmisión de contacto directo e indirecto y a través de aerosoles.
De vuelta a la conferencia. Si a la bacteria le gustan los ambientes fríos, capaz que le gusta vivir en armadillos. A alguien se le ocurrió (hablaremos de este detalle en otro post). Entre 1960-1970 se descubrio que los armadillos infectados por M. leprae en el laboratorio eran un modelo animal espectacular para recrear todas las fases clínicas de la enfermedad. Con este descubrimiento, la promesa de poder obtener bacterias puras para realizar todo tipo de estudios llevó a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a iniciar un programa global para el desarrollo de vacunas y comprender mejor la enfermedad. Lamentablemente estos estudios nunca dieron frutos.
A finales de 1970, se encontró M. leprae en armadillos salvajes. La conclusión inmediata fue que se escaparon del laboratorio pues se encontraron en Louisiana, Estados Unidos (EEUU), el mismo lugar en el que se realizaron los experimentos de infección. Este debate duró hasta los 90s en el que un estudio inmunológico demostró que M. leprae ya circulaba en los armadillos norteamericanos varios años antes de los experimentos mencionados. Estas investigaciones sembraron la semilla de una pregunta incómoda: puede la lepra ser transmitida a seres humanos por armadillos? O más técnico, es la lepra una zoonosis?
Fig 3. El armadillo de nueve bandas (Dasypus novemcinctus) es considerado un reservorio importante de la lepra zoonótica en las Américas. La foto del armadillo es de Joel Sartore como parte del proyecto ‘Arca fotográfica’. Las fotografías de las lesiones son tomadas de Oliveira et al. 2019.
Esta pregunta se debate hasta hoy. Científicamente hablando, la lepra como zoonosis se ha demostrado incontrovertiblemente (o sea definitivo-final-final-sin-dudas), en los estados del sur de EEUU, específicamente en Arkansas, Florida, Georgia, Louisiana, Mississippi, y Texas (hasta escribir esto). Para demostrarlo, Richard Truman y el resto de autores (R. Truman es el mismo autor que puso fin al debate de los armadillos escapando del laboratorio), observaron la totalidad del material genético de la bacteria para demostrar que la misma cepa circulante en seres humanos—que nunca habían viajado a áreas donde la lepra es endémica—estaba también infectando a los armadillos del área. A partir de esos estudios, se ha tratado de replicar este experimento en múltiples ocasiones y en varias regiones del mundo sin éxito. Aquí volvemos al problema de la bacteria incultivable. Ya que es difícil obtener bacterias puras con técnicas microbiológicas y dependemos de colonias de ratones y de armadillos para obtener suficientes bacterias, secuenciar genomas de M. leprae de armadillos y humanos es DIFICILÍSIMO. Cabe mencionar que se desconoce como los armadillos transmiten la enfermedad a los humanos—o incluso si hay transmisión directa—, solo sabemos que son una fuente de infección.
La OMS considera a la lepra como una zoonosis en EEUU y en Brasil. Para la OMS, el riesgo zoonótico es mínimo y por ende "negligible", o sea olvidable, inaparente. En su último reporte llamado “Hacia zero lepra. Estrategia global de lepra (Enfermedad de Hansen) 2021-2030”, la OMS menciona la zoonosis en una sola ocasión. Sin embargo, hasta el momento, se ha encontrado M. leprae en varios animales y en el medio ambiente tantos países endémicos como no endémicos: en ardillas rojas en las islas británicas, en chimpancés en el oeste de África, en armadillos en México y, Colombia, y en el ambiente, y en células de garrapatas y en otros lados que detallaremos luego. Además, pese a la reducción en los reportes de lepra humana, la incidencia global se mantiene constante a pesar de las intervenciones de salud pública. Investigar los reservorios de M. leprae y su posible transmisión zoonótica es crucial si realmente queremos erradicar la enfermedad. Aquí entra nuestro estudio.
EL ESTUDIO
Fig 4. El Instituto de la Biodiversidad es el hogar del museo de historia natural de la Universidad de Kansas. Parte del estudio fue realizado en el laboratorio de biología molecular que está en el tercer piso del museo. Foto: Daniel Romero-Alvarez
Los museos de historia natural son instituciones que van más allá de simples atracciones turísticas. Especialmente en EEUU, estos museos tienen una larga trayectoria como repositorios de especímenes biológicos que colectan, guardan y protegen animales salvajes disecados, tejidos y recursos genéticos. Con el descubrimiento de que aproximadamente ~70% de enfermedades infecciosas tienen un origen animal—o sea son zoonóticas—estos repositorios podrían funcionar como una fuente de información valiosa para detectar patógenos. Esto es precisamente lo que hicimos para este proyecto.
Gracias a que múltiples museos de historia natural se han organizado para publicar sus datos de manera abierta para que cualquier investigador o individuo pueda revisar sus colecciones, con nuestro equipo contactamos 10 museos de EEUU en búsqueda de tejidos de armadillos, específicamente de cualquier integrante de la familia Dasypodidade a la que pertenecen. La intención era utilizar diagnóstico molecular para detectar la presencia de M. leprae en tejidos colectados a través del tiempo y el espacio, ya que algunas muestras venían de lugares tan al sur como Argentina y algunas muestras fueron colectadas antes de que los autores de este artículo naciéramos (e.g., 1976).
El diagnóstico molecular, la estandarización del protocolo y la confirmación de resultados duró aproximadamente dos años. Se hubiera demorado más todavía de no ser por una de las que debería ser característica innata de la ciencia moderna, la colaboración interinstitucional. La única forma de corroborar que los datos que obtuvimos eran confiables era verificarlos con un experto en el tema. No se confundan, estandarizar técnicas de biología molecular para poder decir con certeza que una muestra es positiva o negativa necesita mucha experticia y va más allá de aplicar primers y secuenciar, la aproximación clásica a la que nos orilla el sistema académico del 2020. El mantra de ‘publicar, publicar, publicar’, o el más contemporáneo ‘publica para conseguir fondos’, asegura que haya más cantidad que calidad. Lo que usualmente pasa es algo así: ‘Disculpa, estás seguro que los datos son reales? Naaaah, algunas revistas de ley nos publican’ (update Abril-2023: que les quitan el impact factor a las revistas).
Fig. 5: La mayoría del diagnóstico molecular inicial se realizó en las instalaciones del Museo de Historia Natural de la Universidad de Kansas. Foto por Daniel Romero-Alvarez.
La Dra. Charlotte Avanzi ha trabajado varios años en el campo de la epidemiología molecular de la lepra y ha implementado diferentes métodos para estudiar la distribución y diversidad de M. leprae directamente de muestras clínicas evitando el uso de modelos animales. Le escribí por primera vez a través de Researchgate en enero de 2022. Me respondió muy cordialmente, nos reunimos por zoom un jueves y seguimos colaborando hasta hoy. Utilizando su experticia logramos tres de los hallazgos más importantes de la publicación:
Confirmamos una prevalencia del 14.8% de M. leprae en armadillos de nueve bandas en colecciones de museos.
Encontramos que la cepa de M. leprae circulando en armadillos de Texas, EEUU hace más de 30 años (i.e., cepa 3I-2) es la misma que circula hasta hoy.
Detectamos por primera vez M. leprae en tejidos de armadillos de Bolivia y Paraguay.
Este trabajo se publicó en la edición de marzo de 2023 en la revista de Enfermedades Emergentes de los Centros de Control y Prevención de Enfermedades de EEUU. Además de los tres puntos mencionados, el artículo es una pieza más en el rompecabezas de la dinámica de la transmisión de M. leprae. Corroboramos el rol de los armadillos como reservorio de la bacteria en varias regiones de las Américas y demostramos el valor inmensurable de las colecciones de museos para la investigación de enfermedades infecciosas. Especialmente luego de la crónica de una pandemia anunciada que representó el COVID-19 por SARS-CoV-2, estudios de vigilancia que anticipen la presencia de patógenos en animales salvajes serán fundamentales para prevenir otra tragedia epidémica. Ojalá que logremos hacer algo al respecto. O no...?
Nuestro estudio despertó muchos intereses. Ahora mismo, nuestro equipo se encuentra trabajando en evaluar la presencia de M. leprae en armadillos salvajes de Ecuador, la aplicación de modelos de distribución de especies para sugerir áreas de lepra zoonótica, detección de M. leprae en animales atropellados en Brasil, entre otros. Novedades pronto.
EPÍLOGO
Originalmente, el material suplementario incluía la figura del panel superior.
Los emojis felices representan instancias en las que una amplificación de PCR permite la secuenciación genética de M. leprae y por ende es considerada un verdadero positivo. Los emojis tristes son lo contrario, cuando una amplificación de PCR representa algo que no es M. leprae usando secuenciación y por ende es un falso positivo. Originalmente, estas iban a ser las figuras publicadas, sin embargo en la ronda final de revisión el editor de la revista le apostó a la seriedad y a cuadrar en la sociedad y nos sugirió cambiar los emojis por flechas. El mensaje es el mismo, pero desde mi perspectiva los emojis permiten conectar mejor, la ciencia debería ser un poquito más amigable desde las publicaciones científicas en sí mismas. Sugerí esto, pero sirvió de poco.
AGRADECIMIENTOS
Charlotte Avanzi revisó la versión original del texto e hizo sugerencias enriquecedoras. Es coautora de la publicación académica en la que se basa este paper y para 2023 es la referencia mundial de epidemiología molecular de lepra.